Роль изменения структуры и функции мембран клетки

Проводимый в настоящей главе даже краткий анализ данных об изменении мембран при старении показывает, сколь быстро устанавливалась связь между фундаментальными биологическими исследованиями и изучением механизмов старения в течение последнего десятилетия. Действительно лишь в эти годы были получены основные результаты о свойствах специальных белков-рецепторов, многие из которых встроены в цитоплазматические мембраны. Одни из этих белков воспринимают ("рецептируют") определенные гормоны, другие - белковые факторы роста, а третьи - вещества, участвующие в передаче нервного импульса (нейропередатчики или нейротрансмиттеры, т. е. соединения, благодаря которым возбуждение от одного нейрона передается к другому). Это значит, что регуляция различных функций организма эндокринной и нервной системой осуществляется с участием рецепторов.

Но среди многих биологов и физиологов, изучавших природу старения, уже давно укрепилось мнение о важной роли нейроэндокринных возрастных изменений в старении целостного организма. Вероятно, поэтому почти одновременно с открытием тех или иных рецепторов, как правило, начинали изучать и возрастные изменения этих рецепторов. За прошедшее десятилетие результатов таких исследований опубликовано много не только в биогеронтологической, но и в другой специальной литературе: по мембранологии, нейроэндокринологии, фармакологии, молекулярной кардиологии и т. д. О ряде этих исследований будет рассказано в настоящем разделе главы.

А сейчас одно небольшое пояснение. Дело в том, что, кроме рецепторов, расположенных на поверхности клетки и связывающих нейротрансмиттеры или гормоны, существуют и более глубоко расположенные (цитоплазматические) рецепторы, которые реагируют с относительно легко проникающими через мембрану, например, стероидными половыми гормонами. Затем комплекс рецептор - гормон транспортируется в ядро, где он вызывает активацию определенных генов, следствием чего является индукция синтеза определенных белков, а следовательно, и специфическое изменение метаболизма в определенной ткани - "мишени гормона", имеющей соответствующие рецепторы.

Связывание определенной молекулы (лиганда) с мембранными рецепторами также приводит к "запрограммированным" изменениям: проницаемости мембраны, концентрации циклической аденозинмонофосфорной кислоты (цАМФ) или ионов Са²⁺ и т. д. Происходит это закономерно, потому что рецепторы встроены в мембрану таким образом, что они находятся в контакте с другими определенными макромолекулами, и в случае связывания рецептора "со своим" лигандом изменяется структура не только рецепторa, но и структура и активность других (но определенных) макромолекул, "чувствительных" к рецептору или к изменению концентрации цАМФ или Са²⁺. После такого введения продолжим рассказ о роли мембран в старении.

Функция мембран не ограничена лишь их очевидным свойством - регуляцией путем переноса ионов и других низкомолекулярных веществ. В регуляции биосинтеза ДНК и РНК, переносе последней из ядра в цитоплазму существенное значение имеет ядерная мембрана; биосинтез многих белков протекает на полисомах, "организуемых" мембранами эндоплазматической сети; биосинтез липидов регулируется ферментами, упорядоченными на митохондриальных мембранах. Распад же различных биомакромолекул, их гидролиз осуществляются также в определенных мембранных структурах - лизосомах. Именно благодаря тому, что многие гидролазы ограничены, "упрятаны" в этих структурах, обеспечивается относительная надежность функционирования макромолекул в клетке. Таким образом, все основные биохимические процессы в клетке регулируются мембранами, а функции мембран основаны на их способности контролировать и координировать диффузию и активный перенос субстратов (т. е. перенос вещества против градиента концентрации) в клетку и из нее, от одной органеллы к другой, служить площадкой, на которой происходит специфическая ориентация макромолекул и образование между ними специфических комплексов и формирование органелл (например, полисом), воспринимать внеклеточные сигналы с помощью встроенных в мембраны рецепторов, специфически взаимодействующих с определенными (сигнальными) молекулами, благодаря перечисленным свойствам поддерживать и регулировать определенную форму клеток, рост и состояние их митотической активности. Ядерная мембрана "старых" клеток имеет значительно измененную структуру, что хорошо видно в электронном микроскопе: она образует складки и впячивания внутрь ядра, иногда наблюдается нарушение целостности ее структуры. Эти изменения должны нарушить специфичность взаимодействия ядра с цитоплазмой, уменьшить селективность процессов переноса вещества из ядра в цитоплазму и наоборот. Нарушение переноса должно касаться не только низкомолекулярных веществ, но и передвижения (транслокации) в обоих направлениях биомакромолекул (главным образом РНК из ядра в цитоплазму и ядерных белков из цитоплазмы в ядро).

При старении клеток печени изменяется химический состав цитоплазматических мембран, а точнее, изменяется соотношение различных белков и активность ферментов, входящих в их состав.

Мы уже знаем, что нарушение способности к делению - один из важных признаков старения клеток. Молекулярные механизмы этого нарушения могут быть многообразны и, вероятно, так или иначе связаны с изменением структуры и функции генетического аппарата. На основании только что сказанного можно предположить, что другой клеточной структурой, изменение которой может быть критическим для нарушения в процессе старения способности клетки к делению, является цитоплазматическая мембрана.

Так, ухудшение реакции старых клеток на действие митогенных факторов - одна из основных причин снижения их пролиферативной активности и, вероятно, жизнеспособности, Известно также, что фибробласты кожи новорожденных более чувствительны, чем фибробласты взрослых доноров, к стимулирующему рост действию таких факторов роста, как эпидермальный или тромбоцитарный, а также инсулин. Не только фибробласты кожи, но и кератиноциты новорожденных делятся in vitro более интенсивно, чем кератиноциты взрослых людей, и первые более чувствительны, чем вторые, к стимулирующему рост действию фактора роста кератиноцитов и эпидермального фактора роста (ЭФР). Таким образом, есть основание полагать, что снижение пролиферативной активности и фибробластов и кератиноцитов, происходящее при их старении, связано с возрастным снижением реакции этих клеток на факторы роста, присутствующие в среде роста.

В заживлении ран существенное значение, вероятно, имеет также стимуляция деления фибробластов под влиянием ЭФР. Поэтому весьма важны данные Р. Д. Фихлинса с сотрудниками из Вистарского института анатомии и биологии в Филадельфии о том, что при старении in vitro диплоидных фибробластов человека их реактивность, способность к стимуляции синтеза ДНК под влиянием ЭФР снижаются. Исследования рецепторов к этому фактору, выделенных из фибробластов различных пассажей, показали, что при старении клеток эти рецепторы теряли способность фосфорилировать тирозины белков.

Приведенные данные находятся в соответствии с результатами исследований Юкиаки Курода из Национального института генетики Японии. Он обнаружил, что добавление ЭФР к культурам "молодых" фибробластов человека ускоряет их деление, причем начинают делиться даже клетки, ранее переставшие делиться. Но стимулировать деление клеток старых культур путем добавления к ним факторов роста не удалось.

Что касается неделящихся клеток, то особое значение в старении, по-видимому, имеет изменение их мембран в области контактов (синапсов). Известно, что нарушение структуры и функции этих мембран может снижать скорость и точность передачи информации в нервной системе, что наблюдали в процессе старения и животных, и человека. Последний абзац, взятый из первого издания этой книги, теперь также можно продолжить приведением конкретных фактов, подтверждающих сформулированное в нем предположение об особой чувствительности синаптических мембран к старению и свидетельствующих, сколь бурно, развиваются исследования в рассматриваемой области знаний. При сравнении нервных окончаний крыс в возрасте 5-7 или 23-25 месяцев обнаружены существенные различия их синаптических мембран. Авторы этой работы полагают, что в результате таких изменений нарушается не только функция нервных окончаний, но и жизнеспособность самой нервной клетки, так как при этом в ней увеличивается содержание ионизованного кальция, а это может стать причиной возрастной (спонтанной) гибели нейронов. Подобно тому как в нарушении регуляции митотической активности делящихся клеток имеет значение изменение ее рецепторов, так и уменьшение числа или модификация структуры рецепторов нервных клеток может быть одним из определяющих факторов старения этих клеток.

Значительное количество информации получено относительно следующих видов рецепторов нейромедиаторов: β-адренергических, холинергических и дофаминовых. Обнаружено, что при старении уменьшается число рецепторов по крайней мере в некоторых отделах головного мозга человека и грызунов. Уменьшение количества рецепторов нейромедиатора ацетилхолина (холинергических рецепторов) в коре и гиппокампе пожилых людей может быть биологической основой снижения их способности к запоминанию. Следовательно, возрастные изменения рецепторов можно скоррелировать с функциональными нарушениями. Уменьшение рецепторов для нейромедиаторов связывают с утратой синаптических контактов, отростков или нейронов, причем потеря рецепторов может быть как следствием разрушения этих структур, так, возможно, и причиной такого разрушения, поскольку в некоторых медиаторных системах возрастная потеря рецепторов предшествует возрастным анатомическим изменениям.

Уменьшение при старении чувствительности мембран клеток головного мозга к нейромедиаторам также объясняют уменьшением содержания в них соответствующих рецепторов. В частности, значительно снижается количество дофаминовых рецепторов, связанных с аденилатциклазой. Содержание периферических дофаминовых рецепторов такого типа (например, в почечной артерии кроликов) при старении также значительно уменьшается.

В клетках мозга, вероятно, снижено не только число, но и скорость синтеза адренорецепторов. Так, скорость появления новых мест связывания лигандов, взаимодействующих с такими рецепторами, в гипоталамусе и коре мозга 24-месячных крыс значительно меньше, чем в тех же органах 3-месячных животных. Эти данные были получены Луисом Гринбергом с соавторами из отдела фармакологии медицинского колледжа в Пенсильвании и в Институте психиатрии в Филадельфии. А Георг Рот и Джаклин Генри из лаборатории молекулярных и клеточных исследований Балтиморского геронтологического центра (США) обнаружили снижение на 30% скорости синтеза дофаминовых рецепторов в стриатуме (полосатом теле) головного мозга 24-25-месячных крыс по сравнению с 3-6-месячными.

В Национальном институте старения в Балтиморе были исследованы молекулярные механизмы снижения при старении способности тканей адекватно реагировать на гормоны и нейромедиаторы. Оказалось, что это снижение может быть обусловлено изменением количества и, возможно, структуры и функции определенных рецепторов. Так, в одной из структур головного мозга (полосатом теле) обнаружено снижение количества дофаминовых рецепторов. В гипофизе же снижается число рецепторов к эстрогенам А у рецепторов, расположенных в слюнной железе и специфически реагирующих с катехоламинами, при старении уменьшается эта реакционная способность. Следующие после взаимодействия рецептора со "своим" биологически активным веществом реакции также могут нарушаться при старении. Такое нарушение обнаружено в гипофизе при исследовании реакций, инициируемых взаимодействием эстрогенов со своими рецепторами.

Получены также данные, подтверждающие предположение о том, что снижение способности матки у старых крыс реагировать на воздействие эстрогена является следствием потери рецепторов или ослабления их активности. Таким образом, обнаруживается общая закономерность старения - снижение концентрации рецепторов нейромедиаторов и гормонов (мембранных или находящихся в цитоплазме) в различных клетках. Однако из этого правила имеются исключения. Одно из них обнаружилось при анализе данных работы Малана Кольга с сотрудниками из отдела фармакологии в университете Охио (США). Из такого анализа следует, что мочевой пузырь самцов старых крыс (возраст 29 месяцев) более чувствителен к холинергическим стимулам, и это обусловлено увеличением в клетках мочевого пузыря по сравнению с аналогичными клетками 7-месячных крыс количества мускариновых холинергических рецепторов.

Особенно резкие изменения функции мембран можно наблюдать при старении клеток крови эритроцитов, которые живут в организме недолго (например, в организме человека - несколько месяцев).

В последние годы при исследовании старения и этих клеток обнаружено изменение их рецепторов. Количество инсулиновых рецепторов на эритроцитах определяли радиохимическим методом по связыванию с ними инсулина, меченного йодом-125. Оказалось, что фракция самых молодых клеток содержит наибольшее количество рецепторов. В процессе созревания ретикулоцитов концентрация рецепторов в них уменьшалась очень быстро. По мере же старения зрелых эритроцитов количество рецепторов уменьшалось экспоненциально с полупериодом около 40 дней.

Исходя из термодинамики можно предвидеть спонтанное образование прочных комплексов или даже ковалентных сшивок между мембранными белками, причем такой процесс ускоряется под влиянием перекисей липидов мембран. Поскольку количество последних при старении возрастает, то, вероятно, с возрастом увеличивается и скорость спонтанного "сшивания" мембранных белков, особенно если скорость метаболизма таких белков замедлена. Все это приводит к предположению, что при старении различных клеток в их мембранах, в первую очередь - в мембранах неделящихся клеток, возрастает часть (фракция) высокомолекулярных белков, образуемых в результате сшивания мембранных белков.

А. Бовелли с сотрудниками обнаружили в 1984 году, что в ходе старения эритроцитов на их поверхности появляются ассоциаты белков, скрепленные дисульфидными мостиками и локализованные в мембране. Такие ассоциаты, вероятно, образуются в результате протеолиза и окисления других мембранных или даже цитоплазматических белков. При добавлении к "молодым" эритроцитам АТФ или глутатиона (одного из природных антиоксидантов) в физиологических концентрациях процесс образования в мембране ковалентно сшитых комплексов белков резко ингибируется. Этот факт представляет даже практический интерес. Ведь при хранении крови требуется в максимальной степени сберечь эритроциты, не дать им "постареть". Значит, с этой целью можно попытаться использовать также физиологические концентрации АТФ и(или) глутатиона. Есть основания полагать, что такие вещества окажут благотворное действие и на организм - реципиент донорской крови. Но конечно, эти теоретические предположения должны быть дополнены проверкой их справедливости на различных животных, включая обезьян.

Когда сравнили белки мембранных структур синаптосом коры головного мозга крыс в возрасте 2, 12 и 24 месяцев, то оказалось, что отношение общего количества белка с молекулярной массой, превышающей 5-10⁵, к белкам с массой, меньшей этой величины, у молодых животных составляет 1:3, у взрослых - 1:2,1, у старых - 1:1,3. Относительное увеличение высокомолекулярных фракций белков с возрастом, вероятно, имело существенное значение в снижении функциональных способностей головного мозга, так как центрофеноксин, который по некоторым параметрам тормозит старение мозга и улучшает его функцию у старых животных, будучи введенным старым крысам, "омолаживал" белковый состав мембран синаптосом их головного мозга.

То, что мы сейчас обсуждали, касалось цитоплазматических мембран, отделяющих клетку от окружающей ее внешней среды. Но ведь для нормального функционирования клетки не меньшее значение имеют и мембраны, "пронизывающие" клетку, разделяющие ее на отдельные органеллы, "отсеки" и т. д. Это, в частности, мембраны эндоплазматической сети, на которых происходит синтез многих белков и которые служат стенками каналов, пронизывающих клетку.

С недостаточно активной функцией лизосом связано и накопление в клетках "шлаков", метаболически стабильных комплексов - об их природе и роли в старении будет рассказано позднее.

Теперь рассмотрим физико-химические механизмы старения мембран, знание которых позволит нам глубже понять и биологическую роль самого феномена старения этих структур. Такие механизмы исследовали в основном двумя путями. Один из них состоял в сравнении химического состава высокоочищенных препаратов определенных мембран, выделенных из клеток животных различного возраста.

Таким образом было обнаружено, в частности, что процесс старения изменяет липидный состав митохондриальных мембран. В качестве примера рассмотрим сравнительные данные о жирокислотном составе, содержании холестерина и фосфолипидов в мембранах митохондрий сердца молодых (4 месяца) и старых (33 месяца) крыс-самцов. Оказывается, что в мембранах старых животных значительно увеличено содержание холестерина и процент сфингомиелина и кардиолипина. Среди жирных кислот при этом увеличивалась доля пальмитиновой кислоты, а в кардиолипине - доля длинноцепочечных жирных кислот. При старении у большинства фосфолипидов индекс ненасыщенности уменьшался (у кардиолипина он повышался). Такие изменения мембран должны приводить к изменению их вязкости (точнее, микровязкости), "текучести" митохондриальных мембран, что, в свою очередь, может нарушить способность митохондрий сердца обеспечивать его энергией, а это в конечном счете может приводить к нарушениям сердечной деятельности, наблюдаемым в старческом возрасте.

Понятия "микровязкость" или "текучесть" мембран введены биофизиками, использующими "метки или зонды" - органические молекулы, во-первых, способные флуоресцировать или обладающие парамагнитными свойствами и, во-вторых, способные связываться с липидной или белковой компонентой мембран. В этом случае флуоресцентным методом или методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) можно определить подвижность метки (зонда) при различных температурах, а эта подвижность и ее изменение с изменением температуры по очевидным физическим причинам как раз и определяется подвижностью или микровязкостью тех молекул, к которым пришиты метки (зонды).

С помощью таких методов и было определено, что подвижность ацильных цепей (текучесть липидов) мембран уменьшается при старении клеток. Такие данные были получены, в частности, советскими биофизиками А. Б. Капитановым и В. Г. Ладыгиной во 2-м Медицинском институте. К сходному выводу пришли известные зарубежные исследователи мембран М. Шиницкий и Я. Скорник. Они заключили на основании анализа имеющейся информации по изменению физико-химических свойств мембран при старении, что начальная фаза старения мембран характеризуется существенным изменением состава и физических свойств липидного бислоя, в частности увеличением микровязкости.

В совместной работе В. К. Кольтовер из Института химической физики АН СССР, Р. А. Гуськова из МГУ и автор этих строк методом ЭПР и с помощью спинового зонда, вводимого в липидный бислой мембран микросом, сравнивали физические свойства мембран, выделенных из печени молодых (2-5 месяцев) крыс и старых (22-месячных). Резких возрастных изменений мембран, исследованных при 37°С, мы не обнаружили. Однако сравнение температурных зависимостей "параметра упорядоченности" спинового зонда в них показывает, что структура мембран в процессе старения все же нарушается. Это нарушение может быть связано с изменением степени метилирования их фосфолипидов. Данные, свидетельствующие об этом, интересны и тем, что они показывают возможность обратить вспять определенные (хотя и не все) процессы старения на молекулярном уровне с помощью физиологически активных веществ.

Так, в стриатуме - одном из участков головного мозга крыс - обнаружено увеличение микровязкости липидов мембран при старении, сопровождаемое снижением включения метальных групп в фосфатидилхолин. Длительное же введение старым крысам S-аденозилметионина, являющегося донором метальных групп, снижало микровязкость мембран стриатума до значений, характерных для мембран молодых животных. Количество β-адренергических специфических участков связывания (рецепторов, количество которых при старении в стриатуме уменьшается) после кормления S-аденозилметионином также возвращалось к норме. Однако активность аденилатциалазы при этом оставалась по-прежнему сниженной.

Приведенные данные позволяют связать только что нами рассмотренные данные об изменении с возрастом физических и химических свойств липидного бислоя мембран с заключением о нарушении в процессе старения рецепторной функции мембран. Ведь молекулы белков-рецепторов встраиваются в липидный бислой и функционируют в его окружении или, может быть, точнее - при его участии. Следовательно, если его химический состав и физические свойства становятся не оптимальными, будут затруднены и включение рецепторов в мембрану (и следовательно, уменьшение их количества, действительно наблюдаемого при старении), и нарушение их функции, особенно регуляции их функции, например, при функциональных нагрузках. Это заключение согласуется с интересными данными об изменении липидного состава плазматических мембран клеток мозга и сердца и активности ферментов, входящих в состав этих мембран, полученными Л. Н. Богацкой с соавторами (Институт геронтологии АМН СССР).