Другие механизмы и факторы повреждения генетического аппарата клетки

Все рассмотренные нами до сих пор эндогенные генотоксические факторы были неферментативной природы. Но потенциальную опасность для генома клеток представляют ее собственные ферменты.

Основное значение из ферментов такого рода имеют, вероятно, ДНКазы, вызывающие в ДНК разрывы полинуклеотидных цепей.

Идея о том, что ДНКазы не только участвуют в спонтанной деградации ДНК, но что их активация или усиление их синтеза - механизм "программированного" разрушения клеток в процессе старения или морфогенеза, наверное, впервые была сформулирована в докладе-лекции, прочитанной мною в Киеве на IX Международном конгрессе геронтологов в 1972 году. Тогда эта функция ДНКаз была названа механизмом "самоубийства" клетки, (подробнее об этом ферменте будет рассказано в главе IV).

Хотя пока мы обращаем основное внимание на эндогенные генотоксические факторы, а экзогенные (внешние) будут рассмотрены в главе, посвященной проблемам экогеронтологии, о роли одного физического фактора в спонтанной нестабильности ДНК некоторых клеток человека сказать уместно и здесь. Речь идет об УФ-излучении солнечного света и о клетках участков кожи, не защищенных одеждой или волосяным покровом.

Для таких клеток роль естественного УФ-излучения в нестабильности их генетического вещества сравнима с ролью тепла в его спонтанной нестабильности. Так, сопоставляя результаты расчетов интенсивности достигающего клеток кожи человека УФ-излучения солнечного света в Южных широтах Северного полушария с зависимостью количества образуемых димеров пиримидиновых оснований от дозы УФ-облучения, определенной экспериментально на культивируемых клетках человека, можно заключить: в ДНК каждой клетки человека с белой кожей, в течение часа пребывающего на ярком солнце, образуется примерно 5·10⁴ повреждений, представляющих собой пиримидиновые димеры (т. е. ковалентно сшитые друг с другом пиримидиновые основания, расположенные рядом в одной из полинуклеотидных цепей). Большая часть из них удаляется (вырезается) из ДНК с помощью эксцизионной системы ее репарации.

Но возвратимся к проблеме спонтанных повреждении ДНК. Очевидно, что для понимания молекулярных механизмов старения принципиальное значение имеет вопрос о том, как изменяются с возрастом два рассмотренных фундаментальных, диалектически противоположных процесса возникновение спонтанных повреждений и их репарация. Результаты нескольких исследований (подробнее о них будет рассказано в главе IV) позволяют полагать, что эффективность процесса репарации в старых клетках может быть меньше, чем в молодых. Кроме того, есть основания считать, что нарушение слаженности в работе ансамбля репарирующих ферментов приводит не к залечиванию, а наоборот, к интенсивному повреждению ДНК. Ведь мы видели (см. рис. 6), что на определенном этапе должно происходить своевременное переключение процесса репарации с этапа выщепления оснований на этап синтеза ДНК - заполнения имеющейся в ней бреши. Если же такое переключение почему-то задерживается (например, в клетке понижена концентрация ДНК-полимер азы), и в этом случае экзонуклеаза не может "вовремя остановиться", то процесс деградации ДНК должен стать не физиологическим, а патологическим - процесс репарации "переходит" в свою противоположность, т. е. развивается повреждение генома.

Таким образом, накопление повреждений в геноме стареющих клеток происходит не только вследствие нарушения равновесия между процессами возникновения спонтанных повреждений ДНК и их репарации, но и потому, что уменьшается репарируемость повреждений.

Для того чтобы повреждение могло быть репарировано, оно должно быть доступно для действия репарирующих ферментов. Но ДНК в хроматине ядра находится в упакованном состоянии. Возникающие в некоторых участках генома повреждения ДНК с трудом могут быть "найдены" ферментами репарации. Это особенно относится к тем участкам генома, которые обычно неактивны, синтез РНК на которых не происходит. Если облучить клетку ультрафиолетовым излучением и определить скорость репарации повреждений ДНК, индуцированных этим излучением, то оказывается, что именно в таких участках повреждения ДНК остаются длительное время невосстановленными. Казалось бы, поскольку эти гены функционально неактивны, то и накопление в них повреждений безразлично для клетки. Однако так обстоит дело только до определенной поры. Если клетка вступает в фазу деления, то на таких "испорченных" матрицах будет синтезироваться ДНК с неправильной последовательностью оснований или ДНК, вовсе не содержащая оснований в участке, комплементарном "испорченной матрице". Если в результате повреждений ДНК произойдет нарушение синтеза и распределения между дочерними клетками той пары хромосом, в состав которой такая ДНК входит, клетки могут погибнуть.

Повреждения, возникающие в функционально инертных генах, должны "проявиться" также в тех случаях, когда возникает потребность в их активации, например при гормональной и субстратной индукции синтеза белка и при синтезе антител в ответ на поступление в организм чужеродных антигенов. Во всех этих случаях синтезируемые на "испорченных" матрицах ДНК могут быть функционально неактивными или направлять синтез мутантных белков. Следовательно, рассмотренный процесс накопления повреждений ДНК в тех генах, которые вследствие относительно прочной связи с белками репрессированы (временно или постоянно) и малодоступны для репарации, очевидно, является важной причиной снижения способности старых клеток к индукции синтеза ферментов и антител. Но ведь ранее мы пришли к заключению, что такого рода возрастные изменения определяют уменьшение функциональной способности различных органов, являются характерным признаком старения всего организма. Значит, теперь мы можем определить уровни старения и связи между ними - от молекул до организма.

Существует еще одно обстоятельство, которое делает весьма опасным длительное сохранение в клетках повреждений ДНК. Участки ДНК, содержащие изменения в структуре, вызванные различными повреждающими воздействиями (будь то тепло, ионизирующее или ультрафиолетовые излучения или химические вещества), обладают повышенным "сродством" не только к ферментам, участвующим в репарации этих повреждений, но и к другим белкам. Причем в последнем случае может образоваться химическая, связь (сшивка) между модифицированным участком ДНК и белком (см. рис. 1). После этого клетке труднее провести репарацию ДНК. Более того, такая сшивка ДНК - белок может быть нерепарируемой вообще, что означает необратимое нарушение или, скорее, выключение функции гена.

Ведь независимо от того, в каком синтезе участвует этот ген - в синтезе ДНК или РНК, для обоих этих процессов необходимо, чтобы ферменты, их катализирующие (соответственно ДНК- и РНК-полимераза), продвигались, "скользили" вдоль матрицы. Когда ферменты достигнут участков ДНК, содержащих сшивки ДНК с белком, весьма вероятно, что их продвижение будет остановлено, и, следовательно, редупликация гена, или его транскрипция, окажется незавершенной. Рассмотренный механизм выключения функции гена мы и называем инволюционной репрессией.

В предыдущем издании этой книги автор мог привести лишь один результат изучения изменений ДНК клеток в процессе их старения. Как же продвинулось исследование этого вопроса за прошедшие 11 лет?

Прежде всего обратим внимание на то, что в результате того или иного воздействия на ДНК в ней могут возникать самые различные повреждения, причем в самых различных количествах. Естественно, это очень затрудняет изучение изменений ДНК при старении. Ведь большинство типов повреждений, очевидно, даже к старческому возрасту накапливается в геноме в очень малых относительных количествах (по сравнению с чувствительностью даже самых совершенных методов анализа структуры ДНК). Поэтому, чтобы определить характер повреждений ДНК, возникающих и накапливаемых в геноме клеток при их старении, необходимо теоретически предвидеть наиболее существенные из этих типов повреждений. Об одном способе такого предвидения мы уже рассказали - он состоит в анализе биофизических свойств ДНК и механизмов ее спонтанной (тепловой) нестабильности.

Другой путь - проанализировать характер повреждений ДНК, индуцируемых ионизирующим излучением или химическими веществами, и попытаться определить общие механизмы возникновения этих повреждений. Если есть теоретические основания полагать, что такие механизмы "работают" и в неповрежденной клетке, то можно ожидать, что и в процессе старения с относительно большой вероятностью можно обнаружить накопление повреждений ДНК сходного типа.

Один из наиболее изученных продуктов, образуемых в ДНК после облучения клеток ионизирующей радиацией или в результате воздействия на нее химическими мутагенами, - это гликоль тимина или тимидина. Такие продукты образуются в результате окислительной деструкции ДНК. Но различные вещества (ОН·, O₂, Н₂О₂ и т. д.), способные индуцировать процесс окислительной деструкции ДНК, образуются и в процессе нормального метаболизма. Следовательно, можно было ожидать, что такие продукты возникают и в ДНК необлученной клетки. Косвенно об этом свидетельствует выделение этих продуктов с мочой. Так, по данным, полученным методом хроматографии, ежесуточно каждый человек выделяет с мочой в среднем около 32 нМ этих продуктов. У экспериментальных крыс выделение гликоля тимина или тимидина в 15 раз более интенсивно, чем у человека (если пересчитать количество этих продуктов на 1 кг массы тела).

Максимальная (видовая) продолжительность жизни человека, по мнению многих исследователей, составляет примерно 100 лет. У лабораторных крыс она варьирует в зависимости от линии и достигает 4 лет. Иными словами, человек примерно в 25 раз долговечнее, чем крыса. Таким образом, между интенсивностью выделения гликоля тимина и продолжительностью жизни, возможно, существует обратно пропорциональная зависимость.

Модифицированные нуклеотиды или основания сначала выделяются во внутриклеточное пространство в процессе репарации ДНК с помощью ферментов, вырезающих поврежденные участки ДНК. Лишь затем они или продукты их метаболизма выводятся сначала из клетки, а потом и из организма. Но отсюда следует, что, чем больше выводится этих продуктов с мочой, тем больше их образуется и из ДНК клетки. Стало быть, открывается возможность на основании анализа продуктов метаболизма ДНК в моче делать хотя бы косвенные заключения об интенсивности химической модификации ДНК в клетках и роли таких модификаций в развитии различных болезней (особенно опухолей) и в старении.