Накопление повреждений ДНК в клетках других организмов

Целый ряд исследований возрастных изменений ДНК был проведен в опытах на клетках мышей, крыс или собак. О результатах, полученных методом седиментации в градиенте щелочной сахарозы, уже было вкратце сказано. Здесь поясню, что накопление повреждений ДНК наблюдали, начиная с возраста мышей, который был далек от старческого. Этот результат, в согласии с тем, что мы наблюдали на клетках человека, показывает: физические изменения генетического вещества начинают накапливаться до того, как значительно нарушится его функция, и до того, как начнет снижаться жизнеспособность организма и возрастать вероятность развития тяжелых заболеваний. Но есть веские основания полагать, что накопленные повреждения ДНК подготавливают почву для развития таких изменений для старения в целом.

Приведем пока только один из фактов, свидетельствующих о биологической роли образования и накопления в ДНК щелочно-лабильных участков. Напомню, что такого типа повреждения, как мы рассчитали теоретически, с большой частотой должны возникать спонтанно. Эта частота возрастает после действия на клетки тепла или ионизирующего излучения, а под влиянием времени такого типа повреждения накапливаются в различных клетках млекопитающих.

Рональд Харт с сотрудниками из отдела радиологии медицинского центра в Колумбийском университете исследовали количество щелочелабильных связей в мозге, печени и почках мышей двух семейств, хотя и близких таксономически, но различающихся по продолжительности жизни в 2,5 раза. В обоих случаях наблюдали накопление однонитевых разрывов и щелочелабильных связей в ДНК печени и почек стареющих мышей, причем в печени скорость возрастного накопления повреждений ДНК была больше. Скорость накопления повреждений ДНК и в печени, и в почках короткоживущего вида была больше, чем в ДНК тех же органов относительно долгоживущего вида (точнее, эти скорости были обратно пропорциональны величине продолжительности жизни). Таким образом, можно полагать, что существует определенный предел количества накапливаемых с возрастом повреждений ДНК, и в органах короткоживущих животных этот предел достигается быстрее, чем, в частности, и определяется более короткое время их жизни.

К настоящему времени исследован большой ряд клеток из различных органов человека и животных (мыши, крысы, собаки, крупный рогатый скот), а также растительные и бактериальные клетки. Данные всех этих исследований, во-первых, подтверждают теоретически выведенное нами положение: неустойчивость первичной структуры ДНК - общебиологическая закономерность.

Во-вторых, они приводят к заключению о существовании другой общебиологической закономерности (как необязательном следствии первой) - со временем спонтанные повреждения могут накапливаться в клетках. Второе заключение, очевидно, следует пока считать предположительным. И спускаясь к еще менее доказанному предположению, отмечу вероятное существование такой кинетики возрастных изменений ДНК, что определенные повреждения ДНК, как было сказано, в значительном количестве накапливаются уже в клетках молодого организма. Добавлю еще, что есть данные, свидетельствующие о замедлении в пожилом и старческом возрасте скорости накопления таких повреждений ДНК.

Почему это происходит? Ведь скорость возникновения повреждений ДНК со временем, скорее, возрастает, а не уменьшается (например, вследствие увеличения активности ДНКазы или концентрации эндогенных Н₂О₂, перекисей липидов и других генотоксических метаболитов). На феноменологическом уровне такой парадокс можно было бы объяснить тем, что клетка может накопить лишь такое число повреждений, которое совместимо с сохранением ее жизнедеятельности. Если это число превысит критическое, клетка гибнет. Но мы ведь определяли повреждения ДНК только в жизнеспособных клетках. Учитывая гетерохронность (неравномерность развития во времени) процесса старения даже на клеточном уровне и считая, что такая гетерохронность сохраняется и на уровне ДНК, можно предположить, что замедление скорости накопления повреждений ДНК в пожилом возрасте - кажущееся: гибель клеток с числом повреждений ДНК, близким к критическому, будет уменьшать число повреждений ДНК, регистрируемых в популяции клеток.

Однако возможно, скорость накопления повреждений ДНК в геноме клеток пожилых и старых организмов действительно уменьшается, несмотря на увеличение концентрации эндогенных генотоксически агентов и уменьшение способности клеток к репарации ДНК (о чем подробнее будет рассказано позднее). До сих пор мы не принимали во внимание то важное обстоятельство, что ДНК находится в ядре клетки в упакованном состоянии. Ведь линейный размер ядра клетки млекопитающих составляет несколько мкм, а длина молекул ДНК хромосом, как принято сейчас считать, состоящих из одной молекулы, в десятки тысяч раз больше. Но чем плотнее упакована ДНК, тем, очевидно, она менее доступна для ДНКаз и даже для низкомолекулярных генотоксических факторов. Следовательно, если в процессе старения упаковка отдельных участков ДНК станет более плотной, то скорость не только репарации, но и образования повреждений ДНК действительно уменьшится.

Таким образом, мы подошли к вопросу о том, как изменяется в процессе старения не только первичная структура ДНК, но и организация ДНК в более высокие структуры. Разная степень упаковки ДНК характеризует уже высшие структуры ДНК. Следующий же за первичной является вторичная структура ДНК. Итак, вопрос состоит в том, происходит ли изменение с возрастом вторичной структуры ДНК? Возможны два типа изменений конформации двойной спирали ДНК: она может расплетаться (с образованием денатурированных или однонитевых участков) или не расплетаться, а только изменять свою форму (конформацию).

15-20 лет назад проводилось много исследований, целью которых было определение денатурационных изменений ДНК при старении. Для этого выделяли ДНК из тканей организмов различного возраста, а затем изучали в растворе так называемые кривые плавления ДНК, т. е. выявляли изменения способности ДНК поглощать кванты ультрафиолетового излучения (в максимуме поглощения ДНК) с увеличением температуры раствора. Денатурированная ДНК обладает примерно на ¹/₃ большей такой способностью, чем нативная (целостная) ДНК. Поэтому, сравнивая кривые плавления "молодой" и "старой" ДНК, можно было судить об изменении количества денатурированных участков в двойной спирали или, наоборот, о степени ее нативности. В ряде работ было сообщено о том, что при старении мышей или крыс в ДНК различных их органов происходит накопление денатурированных участков.

Мы тоже ставили подобные опыты, но не нашли существенных изменений. И после анализа физико-химических свойств ДНК и доступных методик ее выделения пришли к заключению: даже если в ДНК с возрастом и накапливаются денатурированные участки, обнаружить это явление современными методами физико-химического анализа невозможно.

Дело в том, что в процессе выделения ДНК и ее очистки от белков она неизбежно должна повреждаться, а места повреждения, в свою очередь, должны быть причиной образования в ДНК денатурированных участков. Но на таком фоне невозможно определить "тонкие" возрастные изменения (а мы полагали, что они действительно тонкие, ведь если бы изменения ДНК были резкими, то клетка неизбежно погибла бы, и от ее ДНК должны были бы остаться лишь низкомолекулярные компоненты).

Относительно недавно разработан принципиально иной способ оценки количества денатурированной ДНК - иммунохимический. Он основан на способности лимфоцитов синтезировать антитела к денатурированной ДНК. Такие антитела были определены в сыворотке крови людей трех возрастных групп: детей (10-11 лет); взрослых молодых (19-22) и пожилых людей (65-68 лет). Неожиданно оказалось, что люди всех возрастных групп содержат необычно большое количество антител к однонитевой ДНК, но особенно много таких антител было у людей первой и третьей групп. У них содержание антител примерно в 2 раза больше, чем у взрослых молодых людей.

Эти данные, кроме того, что они подтверждают грустные замечания великих поэтов ("старость - есть второе детство" или "хладея, мы движемся к началу своему"), интересны еще и потому, что приводят к принципиально новому заключению о физиологической роли денатурированных участков ДНК и(или) антител к ним.

Если исходить из традиционной точки зрения (которую для простоты изложения мы рассматривали до сих пор), то нарушения во вторичной структуре ДНК должны возникать лишь случайно и накопление их с возрастом должно происходить постепенно. Но тогда количество денатурированных участков ДНК (и следовательно, концентрация антител к ним) в сыворотке взрослых людей должно было бы быть больше, чем в сыворотке детей. Наблюдается же обратная закономерность. Правда, в своих рассуждениях мы предполагали, что количество антител в сыворотке крови определяется в основном количеством денатурированной ДНК в клетках. Но это может быть и не так. Например, частичная денатурация ДНК может происходить и в сыворотке. А главное, количество синтезируемых антител может и не изменяться параллельно с изменением количества такой ДНК.

Таким образом, анализ возможных изменении с возрастом количества денатурированной ДНК не привел нас к однозначному заключению о характере этих изменений. Но при этом неожиданно приоткрылась, возможно, важная функция такой ДНК и(или) антител к ней. Однако, как уже отмечалось, нативная ДНК может не только денатурировать, но и менять свою конформацию, оставаясь двойной спиралью.